缺血性心脏病已成为世界范围内死亡的主要原因。它是指心脏的血液灌注减少，导致心脏供氧减少，心肌能量代谢异常，无法支持心脏正常功能。由于心脏完全依赖于心肌的血供，心肌缺血可立即影响心功能。我国传统中医药在治疗和预防心脑血管疾病方面有着悠久的历史，本病属祖国医学的胸痹心悸范畴，其病位在心，由于脏腑功能失调，体内气血津液生化运行障碍，产生气滞、血瘀、痰积等病理变化，从而影响心主血脉的功能，使心脉痹阻。传统中药银杏叶具有活血化瘀的功效，可用于胸痹心痛，瘀血阻络。银杏二萜内酯K是一种由银杏叶中分离的二萜内酯化合物，目前已被报道具有抗衰老、脑保护、保肝等作用。它可通过激活IRE1α/X和结合蛋白1(XBP1)通路减轻内质网应激，保护心脏损伤；还被报道可通过改善氧化应激和线粒体功能障碍，显著保护PC12细胞免受氧化应激损伤。然而，银杏二萜内酯K是否能够减轻氧糖剥夺(oxygen-glucosedeprivation，OGD)对心肌细胞的坏死性凋亡，且其具体机制为何尚不清楚。OGD被广泛应用于体外模拟心脏缺氧缺血模型，简单易行，不仅可以阐明关键的细胞和分子机制，还可用于开发新的心血管保护策略。因此，本研究通过体外OGD刺激H9C2心肌细胞建立缺氧缺血模型，观察银杏二萜内酯K对H9C2细胞的凋亡的作用，并进一步探讨其心肌保护作用和可能的机制。
1.材料与方法银杏二萜内酯K、H9C2心肌细胞、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素、细胞技术Kit-8（CCK-8）、活性氧簇（ROS）检测试剂盒。
2.细胞培养和氧糖剥夺处理
H9C2细胞在DMEM高糖培养基中培养，并添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于37℃含5%CO2的孵箱中培养。OGD实验时，将H9C2用无糖DMEM培养基置于37℃厌氧孵箱(1%O2，5%CO2)中，模拟缺氧缺血损伤4h。OGD结束后，H9C2细胞用不同浓度的银杏二萜内酯K孵育之后，再在37℃条件下，正常培养基(95%O2，5%CO2)下复氧1h，对照组细胞仅在OGD实验时换为高糖DMEM，不做其他处理。
3.细胞活力测定
对数生长的H9C2细胞接种于96孔板中，过夜培养。OGD4h后，H9C2细胞分别孵育12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的银杏二萜内酯K，复氧培养1h。行CellCountingKit-8(CCK-8)试验，用于测定细胞相对存活率。将WST-8(10μl)加入每个孔，然后再孵育2h以使细胞与WST-8反应。由于细胞内脱氢酶可以降低WST-8，从而产生一种黄色产物(甲臜)，可溶于组织培养基中，细胞中脱氢酶活性产生的甲臜染料的数量与活细胞的数量成正比。酶标仪测定nm处的吸光度值。将ODnm值吸光度转换为各组与对照组比较的百分数(%)。
4.ROS含量测定采用2，7-二氯荧光素－二乙酸酯(DCFH-DA)流式细胞仪测定ROS水平。H9C2细胞在6孔板中培养，PBS液冲洗两次，细胞在含有10μMDCFH-DA的无血清DMEM培养基避光孵育37℃20min。然后胰蛋白酶消化法收集样品。所有样品于4℃g离心5min，离心半径为6cm，取上清液。将细胞收集到流式细胞管中，流式细胞术检测nm处的DCFH-DA荧光。
5.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）Trizol试剂提取H9C2细胞总RNA，采用PrimeScriptRTMasterMix逆转录反应合成cDNA。qRT-PCR分析使用SYBR预混料ExTaq按照说明书进行实时荧光定量PCR扩增操作。GAPDH为内参，各基因相对表达量用2-ΔΔCT表示。引物序列如表1。
6.细胞凋亡检测H9C2细胞处理结束后，用预冷PBS冲洗，然后用AnnexinV-FITC/PI避光染色15min，重悬于结合缓冲液，流式细胞仪分析，将凋亡细胞(Annexin-V阳性和PI阴性)与坏死细胞(Annexin-V和PI阳性)区分开来。
1.对照组和OGD处理组不太浓度银杏二萜内酯K处理H9C2细胞活力情况CCK-8结果表明，12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的银杏二萜内酯K并不影响H9C2细胞的细胞活力(P＞0.05)。此外，检测不同浓度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的银杏二萜内酯K对氧糖剥夺的H9C2细胞活力的影响。
结果显示，银杏二萜内酯K能显著提高OGD处理的H9C2细胞活力，且呈剂量依赖性(P＜0.05)。见图1、表2。
2.银杏二萜内酯K降低H9C2细胞内ROS含量与对照组相比，OGD组ROS含量显著增加[(1.01±0.13)%vs.(1.96±0.26)%,t=5.,P＜0.05],不同浓度12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的银杏内酯K处理H9C2细胞1h，可显著减少各组细胞内ROS含量[(1.56±0.07)%、(1.45±0.07)%、(1.24±0.05)%]，呈剂量依赖性(F=19.，P=0.)。见图2。3.银杏内酯K保护OGD诱导的H9C2细胞凋亡采用流式细胞术检测OGD处理H9C2细胞的凋亡情况显示，与对照组相比，OGD处理后，细胞凋亡显著增加[(7.25±0.73)%vs.(27.83±2.27)%，t=14.，P＜0.05];在给予不同浓度银杏二萜内酯K孵育以后，各组细胞凋亡被抑制[(22.16±0.69)%、(15.98±1.02)%、(13.30±0.51)%]，呈剂量依赖性(F=.，P＜0.05)。见图3。
4.各组H9C2细胞中p38MAPK和JNK表达情况为探究银杏二萜内酯K抑制OGD诱导的H9C2细胞凋亡的机制，各组细胞中p38MAPK和JNK的mRNA表达，见表3。
与对照组比较，OGD处理后，p38MAPK和JNK表达显著增加(P＜0.05)，给予25μg/ml银杏二萜内酯K处理后，p38MAPK和JNK表达相对于OGD组显著下降(P＜0.05)。
尽管现代心血管医学研究取得了许多重大进展，心肌缺血仍然是导致公众病和死亡的主要原因之一。心肌缺血是一个导致心脏供血减少的过程，同时导致心脏的供氧减少。根据其病变部位和病变症状，应归属于中医的“胸痹”范畴。现代医学认为心肌缺血的多是由冠状动脉粥样硬化致心血管狭窄、阻塞、以及冠状动脉痉挛而导致心脏供血减少的过程，引起心肌缺氧、缺血，与中医描述的瘀阻心脉、心失所养相吻合。应用数千年的祖国药学是巨大宝库，从经方古籍中挖掘出有效的药物是防治心肌缺血等心血管疾病的有效策略。银杏叶具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘之功效。临床用于瘀血阻络，胸痹心痛，中风偏瘫等。银杏叶提取物，尤其是银杏二萜内酯葡胺注射液，主要包括银杏内酯A、B、K等，已被报道可通过拮抗血小板活化因子(PAF)，从而抑制血小板聚集，可对缺血性卒中具有较强的保护作用。此外，银杏二萜内酯K可通过选择性激活IRE1α/XBP1通路抑制培养的新生大鼠心肌细胞的内质网应激损伤;银杏内酯K还可通过上调大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中MMP表达，减轻其氧化应激，进而抑制caspase－3蛋白活性，保护PC12细胞免受H2O2诱导的细胞凋亡，提示其可能是一种有前途的脑缺血治疗神经保护化合物。本研究结果发现，银杏内酯家族新分离的化合物银杏二萜内酯K能够保护的H9C2细胞免受OGD诱导的凋亡。p38MAPK和JNK通路的选择性抑制在银杏二萜内酯K对缺氧缺血的H9C2细胞保护作用中发挥着重要作用。以上结果表明，银杏二萜内酯K对体外模拟的心肌缺血具有较好的保护作用。研究表明，饥饿和缺氧常触发活性氧ROS的产生，而活性氧ROS可对心肌细胞造成严重损伤。缺氧缺血时大量ROS的产生导致细胞坏死性凋亡。本研究发现，与对照组相比，OGD组ROS含量显著增加(P＜0.05)，不同浓度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的银杏二萜内酯K处理H9C2细胞，可显著减少各组细胞内ROS含量。ROS水平的改变可以部分解释银杏二萜内酯K对H9C2细胞增殖和凋亡的影响。P38和JNK是MAPKs信号组的两个主要成员，被认为是心脑血管疾病的关键调控因子。p38和JNK常被细胞应激因素如ROS、紫外线、γ-射线、促炎因子等激活，激活的p38可以促进p53的磷酸化，抑制p53的泛素化和降解;同样，JNK可磷酸化c-Jun的Ser63和Ser73区域，激活c-Jun的促凋亡作用。本研究结果显示，与对照组比较，OGD处理后，p38MAPK和JNK表达显著增加，给予25μg/ml银杏二萜内酯K处理后，p38MAPK和JNK表达相对于OGD组显著下降，这可能是由于银杏二萜内酯K治疗抑制H9C2细胞p38和JNK通路，从而下调了p38和JNK活性，抑制细胞凋亡。此外，在本研究中，我们发现氧糖剥夺处理可抑制H9C2细胞增殖、促进H9C2细胞凋亡，增加H9C2细胞内ROS生成，并激活P38和JNK促凋亡通路。给予不同浓度的银杏二萜内酯K治疗可显著促进H9C2细胞增殖，降低ROS含量，抑制细胞凋亡，说明银杏内酯K可能是通过抑制ROS诱导的p38和JNK激活，从而发挥抗凋亡效应，提示银杏内酯K可能作为一种潜在的心血保护药物，但银杏二萜内酯K具体是如何调控p38和JNK通路、又具体是如何减轻了心肌组织的凋亡的，尚有待进一步深入研究证实。总之，本研究发现银杏二萜内酯K治疗可显著降低体外培养的H9C2心肌细胞ROS生成，且抑制p38和JNK通路表达水平并抑制细胞凋亡，提示银杏二萜内酯K的抗凋亡效应可能是其心肌保护作用的新机制，上述结果缺血性心肌病的治疗乃至预防提供新的有力实验依据。临床和实验医学杂志
年第18卷第22期
王京、高燕、马医院心内科、陕西省医院心血管内科：陕西省卫生厅项目（编号：SX）折耳根参考文献
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